摘要： 
目的 观察灵芝提取液延缓D-半乳糖致亚急性衰老小鼠皮肤衰老的作用。 
方法 以D-半乳糖致亚急性衰老小鼠为模型，同时背部涂抹灵芝提取液，治疗42 d后，测定小鼠背部皮肤组织匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）含量、脂褐质（LF）含量、羟脯氨酸含量。
结果 灵芝提取液低、中、高剂量均能不同程度提高皮肤中SOD活力，降低MDA含量，减少LF含量，提高小鼠皮肤中羟脯氨酸的含量（P<0.01，P<0.05），且具有明显的量效关系。 
结论 灵芝提取液具有延缓D-半乳糖所致衰老小鼠的皮肤衰老作用。
灵芝Ganoderma lucidum是珍贵的药用真菌，在我国有着悠久的使用历史，具有明显的抗氧化、清除自由基的功效。本文针对灵芝提取液，探讨其在延缓皮肤衰老方面的作用，为灵芝的进一步应用开发提供参考。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试验材料
灵芝提取液。
1.1.2 试验动物
雌性KM小鼠70只，体质量18~22 g，由四川省中医药科学院实验动物中心提供 。
1.1.3 药品及试剂
D-半乳糖；维生素E；总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒；丙二醛(MDA)测试盒；羟脯氨酸测试盒；脂褐质(LF)ELISA检测试剂盒。
1.2 方法1.2.1 动物分组、造模及给药
60只KM小鼠随机分为6组，每组10只：正常衰老组、衰老模型组、阳性药(维E)组、灵芝低剂量组、灵芝中剂量组、灵芝高剂量组。
适应性饲养后进行实验。除正常衰老组每日颈背部皮下注射0.3 mL生理盐水外，其余各组每日颈背部皮下注射5%D-半乳糖0.3 mL，连续注射给药42 d。实验前用脱毛剂将小鼠背部双肩胛之间皮肤脱毛3 cm×3 cm。正常衰老组、衰老模型组每日背部涂抹生理盐水20 μL，阳性药(维E)组每日背部涂抹20%维E 50 μL，灵芝低、中、高剂量组每日背部分别以10%、20%、40%浓度的灵芝提取液50 μL涂抹。
涂抹后，保鲜膜保护0.5 h，连续涂抹42 d。
1.2.2 标本取材方法
实验第43天颈椎脱臼处死各组小鼠，同时处死6~8周龄青年小鼠10只，均取背部脱毛后皮肤组织块约0.5 g，经预冷生理盐水漂洗，除去皮下脂肪和其他结缔组织，滤纸拭干，称定质量，皮肤组织块剪碎后放入匀浆管中，加入9倍质量的预冷生理盐水制成10%组织匀浆(在冰水中进行)备用。
1.2.3 皮肤超氧化物歧化酶活力、MDA含量测定
参照T-SOD试剂盒说明书测定超氧化物歧化酶(SOD)活力。参照MDA试剂盒说明书测定MDA含量。
1.2.4 皮肤LF含量测定
参照LF试剂盒说明书测定LF含量。
1.2.5 皮肤羟脯氨酸、胶原蛋白含量的测定
取各组小鼠背部皮肤组织，去除皮下脂肪和结缔组织后，乙醚干燥后，称取80~100 mg组织块，剪碎，加6 mol·L^-1 HCL 1 mL，放入磨口试管中加盖，95 ℃水解5 h，参照羟脯氨酸试剂盒说明书测定羟脯氨酸含量。样品中胶原蛋白的含量用胶原蛋白中羟脯氨酸含量除以13%进行计算。
1.3 统计学分析
实验的详细数据用SPSS 17.0进行统计学分析，实验数据以平均值±标准差表示，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 实验结果2.1 灵芝提取液对小鼠皮肤中SOD活力、MDA含量、LF含量的影响
与青年小鼠组比较，正常衰老组小鼠皮肤中的MDA含量升高(P＜0.05)，LF含量增加(P＜0.01)，说明随着正常的生长发育，小鼠皮肤出现了老化现象。而与正常衰老组比较，D-半乳糖造成的衰老模型小鼠皮肤中的SOD活力明显下降(P＜0.01)，MDA含量显著升高(P＜0.01)，LF含量提高(P＜0.05)，说明通过连续大剂量给小鼠注射D-半乳糖，造成了稳定的衰老模型。
在此衰老模型基础上，给予小鼠阳性药(维E)和不同剂量的灵芝提取液涂抹，均能不同程度提高皮肤中的SOD活力，降低MDA含量，减少LF含量(P＜0.01，P＜0.05)，且灵芝提取液具有明显的量效关系(表 1)。
表 1 灵芝提取液对小鼠皮肤中超氧化物歧化酶活力、丙二醛含量、脂褐质含量的影响Table 1 Effect of Ganoderma lucidum extract on the activity of superoxyde dismutase，the content of malondialdehyde and lipofuscin in skin tissue of mice

组别	超氧化物歧化酶活力/(U/mgprot)	丙二醛含量/(nmol/mgprot)	脂褐质含量/(ng·mL-1)
青年小鼠组	78.72±10.54	2.68±0.77*	2.25±0.72**
正常衰老组	74.27±5.66	3.48±0.75	3.51±0.40
衰老模型组	52.19±7.43**	5.22±0.78**	4.00±0.37*
阳性药(维E)组	69.05±6.56##	1.97±0.61##	2.83±0.52##
灵芝低剂量组	55.59±6.32	3.00±0.87##	3.13±0.78#
灵芝中剂量组	62.99±5.45##	2.94±0.68##	2.83±0.68##
灵芝高剂量组	68.13±3.50##	2.74±0.68##	2.59±0.63##
注： 与正常衰老组比较，* P＜0.05，** P＜0.01; 与衰老模型组比较，#P＜0.05，# # P＜0.01; 下同。 Notes： compared with control group，* P＜0.05，** P＜0.01; compared with model group，# P＜0.05，## P ＜0.01; the same below.

表选项 
2.2 灵芝提取液对小鼠皮肤中羟脯氨酸、胶原蛋白含量的影响
与青年小鼠组比较，正常衰老组小鼠皮肤中的羟脯氨酸、胶原蛋白含量显著减少(P＜0.01)，说明随着正常生长，小鼠皮肤出现老化现象；而与正常衰老小鼠比较，以D-半乳糖造成的衰老模型小鼠，皮肤中的胶原蛋白含量明显下降(P＜0.05)。 在此基础上，阳性药(维E)和高剂量灵芝提取液的涂抹均能提高小鼠皮肤中胶原蛋白的含量(P＜0.05)(表 2)。
表 2 灵芝提取液对衰老小鼠皮肤中羟脯氨酸、胶原蛋白含量的影响Table 2 Effect of Ganoderma lucidum extract on the content of hydroxyproline and vollagen in skin tissue of mice

组别	羟脯氨酸含量/(μg/mg组织湿重)	胶原蛋白含量/(μg/mg组织湿重)
青年小鼠组	45.53±2.51**	339.81±18.73**
正常衰老组	42.14±2.47	314.46±18.47
衰老模型组	37.56±4.07*	280.32±30.38*
阳性(维E)组	41.57±2.08#	310.22±15.56#
灵芝低剂量组	38.86±3.00	289.99±22.40
灵芝中剂量组	40.55±2.04	302.60±5.26
灵芝高剂量组	41.40±2.81#	308.98±21.00#

表选项 
3 讨论
皮肤衰老的特征是失去弹性和柔软性，出现皱纹、干燥角化、色素过量沉积等。自由基学说认为，皮肤衰老是由于年龄增加，体内如SOD、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶活性降低，清除自由基能力下降，自由基在体内大量堆积，引起脂质过氧化终产物MDA增多。MDA与体内一些生物大分子交联形成Schiff碱，即LF。LF难溶于水，不易被排除，大量堆积于皮肤细胞内出现老年斑。因此，MDA和LF可作为皮肤衰老的评价指标。皮肤是否保持光滑细嫩则主要取决于真皮下的胶原蛋白含量。羟脯氨酸是胶原蛋白的特有氨基酸之一，约占胶原蛋白全部氨基酸残基的13.4%，是维持胶原蛋白纤维稳定性的重要单元，通常羟脯氨酸的含量随着皮肤衰老而降低，是反映胶原蛋白纤维变化的敏感生化指标。随着衰老的发生发展，自由基大量增加可引起胶原蛋白交联、老化，皮肤失去弹性。
本试验采用D-半乳糖所致的衰老小鼠模型，试验结果证实，模型小鼠皮肤中的SOD活力明显下降(P＜0.01)，MDA含量显著升高(P＜0.01)，LF含量增加(P＜0.05)，皮肤中的胶原蛋白含量明显下降(P＜0.05)，说明通过连续大剂量给小鼠注射D-半乳糖，造成了稳定的衰老小鼠模型。通过连续涂抹灵芝提取液与阳性药(维E)，均能不同程度提高皮肤中SOD活力，降低MDA含量，减少LF含量(P＜0.01，P＜0.05)，提高皮肤组织中胶原蛋白含量(P＜0.05)，说明灵芝提取液有较强的抗氧化和清除自由基作用，具有营养皮肤、延缓皮肤衰老的功效。
《神农本草经》记载灵芝可“久食轻身不老，延年神仙”，中医长期以来将其作为滋补强壮、固本扶正的名贵药材，人体试验研究发现，灵芝具有明显抗衰老、抗氧化作用。